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  • 酵母三杂交文库筛选服务

    与酵母双杂交系统相同,三杂交系统也是利用转录激活子调控真核基因转录的特点,许多转录激活子由结构上可分而功能上独立的两个结构域组成。如酵母Gal4转录激活子包括DNA结合域(DNA binding domain,DNA-BD)和转录激活域(activation domain,AD)。将DNA-BD与诱饵蛋白X融合,AD与靶蛋白Y融合,分别构建BD-X和AD-Y重组质粒载体,并在酵母细胞中共表达。如果诱饵蛋白X与靶蛋白Y相互作用,DNA-BD和AD相互靠近,重组成有活性的Gal4转录激活子,DNA-BD与上游激活序列(UAS)结合,而AD则激活下游报告基因(如lacZ或HIS3)的转录。通过检测β-半乳糖苷酶活性可确定LacZ基因的表达水平。此外,HIS3编码咪唑甘油磷酸脱氢酶(His3p),能使酵母在组氨酸缺陷培养基上生长。3-氨基-1,2,4三唑(3-AT)是His3p的竞争性抑制剂,His3p表达水平高的细胞能在含有较高3-AT浓度的培养基上生长,因此,酵母细胞对3-AT的抑制水平体现了蛋白-蛋白相互作用的强度。


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    酵母三杂交文库筛?。?/span>


    1.实验原理

    与酵母双杂交系统相同,三杂交系统也是利用转录激活子调控真核基因转录的特点,许多转录激活子由结构上可分而功能上独立的两个结构域组成。如酵母Gal4转录激活子包括DNA结合域(DNA binding domain,DNA-BD)和转录激活域(activation domain,AD)。将DNA-BD与诱饵蛋白X融合,AD与靶蛋白Y融合,分别构建BD-XAD-Y重组质粒载体,并在酵母细胞中共表达。如果诱饵蛋白X与靶蛋白Y相互作用,DNA-BDAD相互靠近,重组成有活性的Gal4转录激活子,DNA-BD与上游激活序列(UAS)结合,而AD则激活下游报告基因(如lacZHIS3)的转录。通过检测β-半乳糖苷酶活性可确定LacZ基因的表达水平。此外,HIS3编码咪唑甘油磷酸脱氢酶(His3p),能使酵母在组氨酸缺陷培养基上生长。3-氨基-1,2,4三唑(3-AT)是His3p的竞争性抑制剂,His3p表达水平高的细胞能在含有较高3-AT浓度的培养基上生长,因此,酵母细胞对3-AT的抑制水平体现了蛋白-蛋白相互作用的强度。

     1 蛋白三杂交系统

    Fig. 1 protein-dependent three-hybrid system


    与酵母双杂交系统不同,三杂交是研究两个蛋白和第三个成分间的相互作用,通过第三个分子使两个杂合蛋白相互靠近。第三个成分不同,可以是蛋白、RNA或小分子。在以蛋白为基础的三杂交系统中,蛋白XY的稳定相互作用依赖于蛋白Z的存在,Z介导相互作用或诱导一个蛋白的构象改变(如X),从而促进与另一个蛋白Y的相互作用(图1)。在以RNA为基础的三杂交系统中,DNA结合域(LexA BDGal4 BD)与RNA结合蛋白(如MS2-外壳蛋白或Hiv-1 RevM10)融合成第一个杂合蛋白,转录激活域(Gal4 AD)与感兴趣的RNA结合蛋白Y融合成第二个杂合蛋白。第三个杂合RNA分子包含与第一个RNA结合蛋白(MS2RRE)结合的位点(RNA)以及RNA结合蛋白Y结合的位点X。蛋白YRNA结合位点X结合形成具功能的转录激活子(图2)。在小分子三杂交系统中,第三个杂合分子为异源二聚化的小分子复合物(如Dex–FK506,DeX-Mtx,使BD-XAD-Y融合蛋白相互靠近,重新组成具有功能的转录激活子(图3)。在SenGupta[1] 最早提出的三杂交系统中,第一个杂合蛋白LexABD-MS2由酵母的L-40膜蛋白编码,第二个杂合蛋白Gal4AD-Y由质粒表达,杂合RNA 分子由RNA聚合酶Ⅲ产生,包括RNAse P 5′前导序列和3′尾随序列(位于mRNA终止密码子后)。RNA聚合酶Ⅲ含有一段由4个或多个T残基形成的转录终止子,而许多RNA 结合蛋白识别富含URNA靶标,不能被RNA聚合酶Ⅲ转录。Putz[2]利用RNA聚合酶Ⅱ转录RNA杂合分子,从而避免富含U的靶RNAs成熟前的转录终止。


                                                      图2 RNA介导的三杂交系统                                      图3 小分子三杂交系统

                                    Fig.2  RNA-dependent three-hybrid system            Fig.3 Small molecule three-hybrid system

    2. 我们的工作内容

        您只需提供用于筛选的诱饵质粒信息,我们会完成整个的筛选工作,主要包括以下内容:
    2.1 诱饵载体的构建
    2.2 诱饵质粒的自激活检测
    2.3 文库质粒和诱饵质粒共转酵母感受态细胞
    2.4 文库筛选和3AT优化
    2.5 文库筛选结果测序分析
    2.6 筛选结果回转验证
    2.7 详细报告的整理和数据发送

    3.交付结果

    提供详细的、完整的实验报告,清晰的实验图片,筛选结果的测序结果,质粒等。

    4.服务报价

    3.2万元整

    5.服务周期

    80个工作日


    文库构建

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