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  • Invitrogen-Gateway方法酵母双杂交文库构建(核系统与膜系统)以及酵母单杂交文库构建(核系统)

    我们可以提供基于invitrogen的gateway方法的文库构建系统,该系统具有以下优点:

       1)我们从mRNA为模板直接进行cDNA双链的合成,没有经过任何扩增的过程,保证了文库的质量和忠实性。 

       2)使用目前市场高质量的反转录酶,保证文库的片段长度和全长率,普通文库的全长率会在50%以上。    

       3)使用gateway高效率的片段和载体重组连接方法,连接效率很高,可以大大提高原始文库的库容量(可以达到1*10^7 CFU 以上的原始文库库容量)。 

    • 产品详情

    服务报价:3万元整,免费赠送3个读码框处理,以确保蛋白可以正常表达。

    可以选择增加提供转化到酵母的文库,可以提供足够100次筛选的酵母转化菌液文库,同时还会提供质粒文库。

    可选均一化处理,可以有效提高低丰度基因筛选检出率。

    服务时间:25个工作日内 


    我们拥有多年的文库构建经验,已完成数千个各类文库构建,我们构建文库的成功率为98%以上。 

    一、产品介绍:

     我们可以提供基于invitrogen的gateway方法的文库构建系统,该系统具有以下优点:

           1)我们从mRNA为模板直接进行cDNA双链的合成,没有经过任何扩增的过程,保证了文库的质量和忠实性. 

           2)使用目前市场上高质量的反转录酶,保证文库的片段长度和全长率,普通文库的全长率会在50%以上。       

           3)使用gateway高效率的片段和载体重组连接方法,连接效率很高,可以大大提高原始文库的库容量(可以达到1*10^7 CFU 以上的原始文库库容量)。 

           4)该系统的文库会有初级文库提供,初级文库的载体为pDONR221,可以方便地将该样本的文库再构建到其他任意载体上,形成其他用途的文库,比如:pPR3-N、PET22b、PET19b、pYD1、pPRC9K、pLenti6.3、pET32b、pDest52、pDEST17等任意载体。

     但该方法相对于我们的All-Direct系统也有一些缺点:

            1.由于Gateway系统的重组臂是变化的,而且attL重组臂里带有终止密码子,且这个重组臂有100多个碱基,很长,为了减少重组臂对蛋白表达的影响,不得不经过2次重组,以让最终文库的载体里不会带有attL重组臂,但还是会引入一个20多个碱基的attB重组臂,对表达或多或少还是有一点影响。

            2.由于必须经过2步重组,就需要进行初级文库的转化,摇菌扩增,质粒提取过程,而摇菌过程类似于PCR扩增的过程,是一个快速扩增的过程,这个过程中会存在基因之间的竞争性抑制效应,会造成高丰度的基因占的比例越来越多,低丰度的比例越来越少甚至丢失,而很多公司采用液体培养的方式,更加大大的增加了这个丢失效应,据我们的多年经验数据,每经过一次扩增和质粒提取过程,高丰度的基因与低丰度的基因拷贝数差异会扩大20倍以上,文库的平均插入片段会降低200bp左右。如果之前有做均一化处理,这一步的扩增,就基本会抵消均一化的作用。我们公司降低消除摇菌扩增的影响,做了一些技术上的改进,但还是会有一些影响的。

    我们公司有另外一套All-direct系统的文库构建,相对于gateway方法,优点是避免了一次初级库的构建和菌液扩增以及质粒提取步骤,可以避免gateway方法的一些缺点,且重组效率等指标与gateway方法一致。缺点是,infusion方法不太适合一个样本一次的RNA分离和cDNA合成,同时构建到3个以上的载体上,可以一次同时构建到1-3个载体,形成1-3个文库,对于绝大多数情况,并不需要将一个样本构建到多个文库载体上,这个足够满足需要了。


    二、实验步骤

    2.1.RNA提取 

    2.2.mRNA分离 

    2.3.cDNA合成(使用酶促法直接合成,不经过PCR扩增过程,比SMART方法质量大大提高) 

    2.4.cDNA长度分级(和均一化处理)

    2.5.分级后的cDNA与pDONR221载体进行gateway BP重组,形成初级文库。

    2.6 初级文库的电转化和涂板培养。

    2.7 初级文库检测。

    2.8 初级文库铺板扩增和质粒提取。

    2.9 初级文库质粒与酵母文库载体pGADT7(pGADT7-Rec2)进行gateway LR重组,形成次级文库。

    2.10 次级文库的电转化和涂板培养。

    2.11 次级文库检测。

    2.12 次级文库铺板扩增和质粒提取。

    2.13 包装和发货

    三、产品内容 

        1)初级文库的甘油菌液(含20%甘油的LB培养基)

          2)酵母文库的甘油菌液(含20%甘油的LB培养基)

          3)初级文库质粒

          4)酵母文库质粒,

          5)随机克隆子的PCR鉴定图谱

          6)文库构建报告。

    四、质量标准   (初级文库和次级文库指标相同)

          3.1 文库库容量:大于1*10^7CFU。

          3.2 平均插入片段:大于1.2Kbp。

          3.3 阳性率:大于95%。  

    五、服务时间

          25个工作日内

          如需转化酵母延长15个工作日。 

    六、材料要求:

     客户构建指定的酵母双杂交cDNA文库,由客户提供组织、细胞或总RNA给我们即可:

     细胞样本:细胞数量大于1*10^7 
     动物样本:大于1g 
     植物样本:大于2g 
     总RNA:大于500ug 

    七、客户案例:

           目前我们已经成功完成数千个不同样本的文库构建,主要客户为中国科学院上海植物生理生态研究所、上海交通大学、浙江大学、浙江省农科院、山东省农科院等多家单位完成酵母双(单)杂交文库构建服务,物种包括人、小鼠、大鼠、水稻、拟南芥、牡丹、稻飞虱、苹果、油菜、小麦、贝壳、葡萄、真菌等。

    八、文库筛选:

           我们是国内极少数能同时提供文库构建和文库筛选的公司,对于酵母双杂交筛选服务,您只需要提供诱饵基因序列即可,我们会进行以下工作,筛选的报价为3万元整:

         1.诱饵载体的测序验证以及构建到双杂交筛选载体上
         2.诱饵基因的自激活检测,检测通过后继续下一步实验。
         3.诱饵质粒转化酵母细胞,验证合格后再转化文库质粒
         4.酵母筛选和3AT条件优化
         5.筛选结果的测序
         6.筛选结果的回转验证
         7.筛选结果递交:包括筛选报告,筛选结果的测序结果和blast结果,筛选结果克隆的质粒实物。

    九、FAQ:

    9.1. 如何选择合适的文库构建方法进行建库?

          我们是市场上可以同时提供3种文库构建方法的公司,这也足以看出我们公司的技术实力。
    3种方法的比较如下:

          1) Clonetech 的SMART方法,该方法基本是被淘汰的,我们上文有详细的技术比较,其好处就是RNA的起始量可以很小,一般只需要几ug即可,该方法成本很低,一般不建议选择。

          2) Invitrogen的方法,该方法质量上较SMART方法要好很多,其对试剂的质量要求也很高,需要全部使用invitrogen的原厂试剂。我们全部使用invitrogen公司试剂进行构建,且做了一些技术改进,提高了文库质量。该方法对起始的RNA要求较高,建议起始用量是大于200ug。但该方法有一个严重的缺点,就是需要进行两次重组才能得到酵母文库,而多一次重组就会多一次文库扩增过程,会严重影响文库质量。在上文中有详细的技术比较和介绍。
           别的使用该方法建库的公司,只能使用商业化的试剂盒构建文库,没有做任何改进。且由于进货渠道的原因,试剂盒内的有些试剂他们是买不到的,质量就会大打折扣。比如DH10B 电转化感受态细胞,这个感受态细胞转化效率比国产的高出100倍以上。这个感受态细胞需要具有一堆的海关批文才能买到,其他公司由于没有相关资质,是无法进口的,据我们了解,国内某公司居然会用化学转化细胞代替电转化,质量影响巨大。

           3) All-Direct方法,这个是我们的改进方法,是在invitrogen方法上做了重要改进,保留了其优点(不用PCR扩增,文库保真度高),去除了其需要经过两次重组的缺点,大大提高文库质量。平均长度较invitrogen方法可以提高200bp,库容量可以提高10倍以上。该方法对RNA的要求量和invitrogen方法一样。

    9.2. ??粕锾峁┑慕湍杆游目庥心男┎纺谌??

           我们提供的文库产品,包含了文库质粒(大于500ug)以及大肠杆菌文库甘油菌。同时可以选择提供转化到酵母细胞的文库甘油菌,我们会提供100只转化到酵母细胞的文库甘油菌,可以做100次的文库筛选。
           其中文库质??梢允褂霉沧姆椒ń形目馍秆?,酵母细胞文库甘油菌可以使用maiting的方法进行文库筛选,根据老师的实验习惯可以自由选择,结果没有任何差异的。

    9.3. 如何检测文库质量?

           对于文库的质量,一个简单的金标准就是,样本内的所有基因都在文库里,且基因要有一半以上的全长基因,这个文库就是合格的。
           对于文库的检测,可以针对我们交付的产品,做以下几个方面的检测:
           根据老师的样本信息,选择3-5个低拷贝的基因,设计合成引物,以我们提供的文库质粒为模板,进行PCR扩增,如果低拷贝的基因都能扩增出来,高拷贝的就不会丢失,文库质量即可以判断为合格。
            对于我们提供的大肠杆菌文库甘油菌,可以进行梯度稀释后铺板培养,第二天计算库容量,同时挑取单克隆进行PCR扩增和测序检测,以判断插入片段长度和空载率。

    9.4. 如何评价文库质量?

           文库质量的关键指标,主要是文库库容、空载率及插入片段平均长度。
           文库的原始库容肯定是越高越好,我们公司承诺的是大于1*10^7的库容量,这个是原始库容量,也就是没有经过任何扩增过程,直接转化出来的库容量。比其他公司承诺的1*10^6的库容量要高10倍以上,下面详细解释下库容量的高低对文库质量的影响:
           生物样本,除了低等生物,目前研究比较多的物种,比如人,大鼠,小鼠,其基因数在5*10^4左右,文库至少得100倍覆盖,也就是库容至少需要5*10^6以上。
           对于植物样本,其基因数量比人的大很多,比如水稻样本,其基因数量为人的2-3倍,小麦样本,其基因数量为人的5-6倍,这样就需要更多的文库库容量。对于水稻样本,需要覆盖100倍的基因数,要求的文库原始库容量是大于1*10^7以上。市场上别的公司提供的文库只能覆盖10倍左右,这么低的覆盖度,必然造成大量基因的丢失。
           对于有的公司宣传的,库容量不是越高越好,这是不负责任的忽悠,为自己的文库质量不合格找不合理的借口。
           对于插入基因长度,别的公司一般平均长度就在800bp左右,我们公司可以承诺做到1200bp以上,这个差距是巨大的,下面再详细介绍下插入片段长度对文库质量的影响:
          一般的一个功能基因,其一般长度会在200个氨基酸以上,也就是编码区在600bp碱基以上,装入文库的基因,除了编码区,还会有5’UTR区,3‘UTR区以及polyA区域,这几个部分加起来,基因的长度一般至少会在1000bp以上。由于文库是个混合物,会存在竞争性抑制,短的基因过多,势必会影响长度基因的比例,以及长的基因的表达丰度。
           我们的文库产品,插入片段平均长度会在1200bp以上,短的会在1000bp左右。对于文库筛选,不是说只要有基因的一个片段就可以了,蛋白质的功能需要多种因素的参与,如果插入基因过短,筛选到的结果只是一个基因片段,甚至是靠近polyA的一小段基因,这个结果的可行度在哪里?基本都可以认为是假阳性的结果的。
           对于有些公司宣称的,文库的基因插入片段不是越长越好,其实是对客户的极其不负责任和不合理的忽悠,只是因为自己没有技术做到更长的片段长度,而找的理由。

    9.5. Mating和共转两种筛库方法哪种好?

           共转和maiting两种方法,结果是一样的,只是一个文库质粒转到酵母细胞的方法,对于后续的文库筛选没有区别的,可以根据老师的实验习惯,自由选择的。


    9.6 公司文库构建和筛选经验有多久?

           本公司从事各类文库构建和筛选长达10多年,特别是酵母文库,是国内一直完全自己做文库构建和筛选的公司。不像有的公司宣称有10多年文库构建经验,实际上真实情况是其invitrogen系统的文库构建经验只有2-3年,2-3年前其所有的invitrogen系统文库都是外包给某公司做的,只是个二道贩子而已,由于自己一直做不好,才不得不一直外包。文库构建和筛选,经验很重要,长的经验积累,可以保证产品质量和稳定性,一次成功率等。



    十、客户文章示例

    核蛋白酵母双杂交文库客户文章示例:

    【1】Yeast-2-Hybrid data file showing progranulin interactions in human fetal brain and bone marrow libraries[J],Data in Brief, Volume 9, December 2016, Pages 1060-1062

    【2】Zhenhai Yu, Yingying Ge, Lei Xie,et al. Using a yeast two-hybrid system to identify FTCD as a new regulator for HIF-1α in HepG2 cells[J],Cellular Signalling, Volume 26, Issue 7, July 2014, Pages 1560-1566

    【3】Zhanyang Yu,1 Ning Liu,1 Yi Wang,2 Xiaokun Li,et al. Identification of Neuroglobin-interacting Proteins Using Yeast Two-hybrid Screening. Neuroscience. 2012 Jan 3; 200: 99–105.

    【4】Cui LG, Shan JX, Shi M, et al. DCA1 Acts as a Transcriptional Co-activator of DST and Contributes to Drought and Salt Tolerance in Rice. PLoS Genet. 11, e1005617 (2015).

    【5】Jing Ning, Baocai Zhang, Nili Wang, Increased Leaf Angle1, a Raf-Like MAPKKK That Interacts with a Nuclear Protein Family, Regulates Mechanical Tissue Formation in the Lamina Joint of Rice. The Plant Cell, Vol. 23: 4334–4347, December 2011.

    【6】Raksha Singh, Mi-Ok Lee, Jae-Eun Lee, Jihyun Choi, Rice Mitogen-Activated Protein Kinase Interactome Analysis Using the Yeast Two-Hybrid System. Plant Physiology, September 2012.Vol.160,

    【7】X.F.Zha, M.Zhao, C.Y.Zhou, H.Z.Guo. Analysis of interaction between Bmhrp28 and BmPSI in sex-specific splicing of Bombyx mori Bmdsx gene. Genetics and Molecular Research 13 (3): 5452-5462 (2014)

    【8】Chao Zhang, Rongchao Ge, Junwen Zhang, Identification and Expression Analysis of a Novel HbCIPK2-Interacting Ferredoxin from Halophyte H. brevisubulatum.PLOS. December 4, 2015.

    【9】Deng X1, Guo D2, Yang S1, Shi M1, Chao J1, Li H2, Peng S2, Tian W1. Jasmonate signalling in the regulation of rubber biosynthesis in laticifer cells of rubber tree, Hevea brasiliensis. J Exp Bot. 2018 Jun 27;69(15):3559-3571. doi: 10.1093/jxb/ery169.


    酵母单杂交文库客户文章示例:

    【1】Nobutaka Mitsuda,Miho Ikeda,Shinobu Takada,et al.Efficient Yeast One-/Two-Hybrid Screening Using a Library Composed Only of Transcription Factors in Arabidopsis thaliana.Plant Cell Physiol (2010) 51 (12): 2145-2151.

    【2】Chang-Qing Yang1, Xin Fang1, Xiu-Ming Wu1, et al. Transcriptional Regulation of Plant Secondary Metabolism. Journal of Integrative Plant Biology 2012, 54 (10): 703–712

    【3】Zejun Huang, Zhijin Zhang, Xiuling Zhang,et al. Tomato TERF1 modulates ethylene response and enhances osmotic stress tolerance by activating expression of downstream genes. FEBS Letters.Volume 573, Issues 1–3, 27 August 2004, Pages 110-116

    【4】Deng X1, Guo D2, Yang S1, Shi M1, Chao J1, Li H2, Peng S2, Tian W1. Jasmonate signalling in the regulation of rubber biosynthesis in laticifer cells of rubber tree, Hevea brasiliensis. J Exp Bot. 2018 Jun 27;69(15):3559-3571. doi: 10.1093/jxb/ery169.

    膜蛋白双杂交文库客户文章示例:

    【1】Yasuyuki Nakamura, Jun Ishii, Akihiko Kondo. Rapid, Facile Detection of Heterodimer Partners for Target Human G-Protein-Coupled Receptors Using a Modified Split-Ubiquitin Membrane Yeast Two-Hybrid System.PLOS one. June 2013 , Volume 8 ,Issue 6.

    【2】Zhe Ma, Hui Zhang, Junxi Zheng. Interaction between M-Like Protein and Macrophage Thioredoxin Facilitates Antiphagocytosis for Streptococcus equi ssp. Zooepidemicus.PLOS one. February 2012 ,Volume 7, Issue 2.

    【3】Pratima Pandey and Singh Harbinder. The Caenorhabditis elegans D2-like dopamine receptor DOP-2 physically interacts with GPA-14, a Gαi subunit. Pandey and Harbinder Journal of Molecular Signaling 2012.

     中文论文:

    【1】张云云,周 君, 李 晔. 可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)酵母双杂交文库和铁结合蛋白真核表达载体的构建. 海洋与湖沼,44卷,第6期。

    【2】欧阳沫, 唐潇,黄惜,袁红梅。巴西橡胶树HbICE1 基因酵母双杂交诱饵载体的构建及互作蛋白的筛选。植物科学学报,2016,34(2): 255~262.

    【3】岳珊珊,夏来新。酵母双杂交筛选与果蝇C(2)M相互作用的蛋白。遗传,2015.11,37(11)

    【4】专利:一种结合串联重复序列(TTTACAC)5的Dof蛋白质



    文库构建

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