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  • 酵母单杂交文库筛选技术服务

    我们拥有多年的文库构建和筛选经验,已完成数千个各类文库,订单来自海内外,可以有效保证文库的覆盖度和文库筛选目的基因的检出。

    • 产品详情

    酵母单杂交文库筛选技术服务(使用clonetechpGADT7或者pGADT7-Rec2两套系统进行筛选,可以使用预制商业化文库或者本公司定制构建的酵母杂交文库)

      1.酵母单杂交的基本原理

           酵母单杂交技术是1993年由酵母双杂交技术发展而来的,其基本原理为:真核生物基因的转录起始需转录因子参与,转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成,即DNA结合结构域(DNA—bindingdomain,BD)和转录激活结构域(activationdomain,AD)。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子,GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端,含有几个锌指结构,可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS),而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用,提高RNA聚合酶的活性。在这一过程中,DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。据此,我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为文库蛋白编码基因,只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用,同样可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶,启动下游报告基因的转录。                                 

     2.酵母单杂交技术的特点

            酵母单杂交体系自1993年由Wang和Reed创立以来,在生物学研究领域中已经显示出巨大的威力。应用酵母单杂交体系已经验证了许多已知的DNA与蛋白质之间的相互作用,同时发现了新的DNA与蛋白质的相互作用,并由此找到了多种新的转录因子。近来,已有应用酵母单杂交体系进行疾病诊断的研究报道。随着酵母单杂交体系的不断发展和完善,它在科研、医疗等方面的应用将会越来越广泛。采用酵母单杂交体系能在一个简单实验过程中,识别与DNA特异结合的蛋白质,同时可直接从基因文库中找到编码蛋白的DNA序列,而无需分离纯化蛋白,实验简单易行。由于酵母单杂交体系检测到的与DNA结合的蛋白质是处于自然构象,克服了体外研究时蛋白质通常处于非自然构象的缺点,因而具有很高的灵敏性。目前,多种酵母单杂交体系的试剂盒和相应的cDNA文库已经商品化,为酵母单杂交体系的使用提供了有利的条件。
        但酵母单杂交也存在以下缺点:有时由于插入的靶元件与酵母内源转录激活因子可能发生相互作用,或插入的靶元件不需要转录激活因子就可以激活报告基因的转录,因此往往产生假阳性结果。如果酵母表达的AD融合蛋白对细胞有毒性,或融合蛋白在宿主细胞内不能稳定地表达,或融合蛋白发生错误折叠,或者不能定位于酵母细胞核内,以及融合的Gal4AD封闭了蛋白质上与DNA相互作用的位点,则都可能干扰AD融合蛋白结合于靶元件的能力,从而产生假阴性结果。

     3.酵母单杂交的基本操作过程

         (1)设计含目的基因(称为诱饵)和下游报告基因的质粒,并将其转入酵母细胞。
        (2)将文库蛋白的编码基因片段与GAL4转录激活域融合表达的cDNA文库质粒转化人同一酵母中。
        (3)若文库蛋白与目的基因相互作用,可通过报告基因的表达将文库蛋白的编码基因筛选出来。在这里作为诱饵的目的基因就是启动子DNA片段,文库基因所编码的蛋白就是启动子基因结合蛋白。

     4.酵母单杂交技术的用途

          迄今为止,应用酵母单杂交体系已经识别并验证了许多与目的DNA序列结合的蛋白质,同时单杂交技术还被应用于识别金属反应结合因子。正向与反向单杂交体系的结合,还可用于筛选阻碍DNA与蛋白质相互作用的突变的单个核苷酸. 目前,在研究DNA—蛋白质相互作用中,酵母单杂交体系主要有以下3种用途:①确定已知DNA—蛋白质之间是否存在相互作用;②分离结合于目的顺式调控元件或其他短DNA结合位点蛋白的新基因;③定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合结构域,以及准确定位与DNA结合的核苷酸序列。

     5.我们的工作内容

        您只需提供用于筛选的诱饵质粒信息,我们会完成整个的筛选工作,主要包括以下内容:
        3.1 诱饵载体的构建
        3.2 诱饵质粒的自激活检测
        3.3 文库质粒和诱饵质粒共转酵母感受态细胞
        3.4 文库筛选和3AT优化
        3.5 文库筛选结果测序分析
        3.6 筛选结果回转验证
        3.7 详细报告的整理和数据发送

     6.交付结果

        提供详细的、完整的实验报告,清晰的实验图片,筛选结果的测序结果,质粒等。

     7.服务报价

        3万元整

     8.服务周期

        80个工作日

    9.客户文章示例

    核蛋白酵母双杂交文库客户文章示例:

    【1】Yeast-2-Hybrid data file showing progranulin interactions in human fetal brain and bone marrow libraries[J],ata in Brief, Volume 9, December 2016, Pages 1060-1062

    【2】Zhenhai Yu, Yingying Ge, Lei Xie,et al. Using a yeast two-hybrid system to identify FTCD as a new regulator for HIF-1α in HepG2 cells[J],Cellular Signalling, Volume 26, Issue 7, July 2014, Pages 1560-1566

    【3】Zhanyang Yu,1 Ning Liu,1 Yi Wang,2 Xiaokun Li,et al. Identification of Neuroglobin-interacting Proteins Using Yeast Two-hybrid Screening. Neuroscience. 2012 Jan 3; 200: 99–105.

    【4】Cui LG, Shan JX, Shi M, et al. DCA1 Acts as a Transcriptional Co-activator of DST and Contributes to Drought and Salt Tolerance in Rice. PLoS Genet. 11, e1005617 (2015).

    【5】Jing Ning, Baocai Zhang, Nili Wang, Increased Leaf Angle1, a Raf-Like MAPKKK That Interacts with a Nuclear Protein Family, Regulates Mechanical Tissue Formation in the Lamina Joint of Rice. The Plant Cell, Vol. 23: 4334–4347, December 2011.

    【6】Raksha Singh, Mi-Ok Lee, Jae-Eun Lee, Jihyun Choi, Rice Mitogen-Activated Protein Kinase Interactome Analysis Using the Yeast Two-Hybrid System. Plant Physiology, September 2012.Vol.160,

    【7】X.F.Zha, M.Zhao, C.Y.Zhou, H.Z.Guo. Analysis of interaction between Bmhrp28 and BmPSI in sex-specific splicing of Bombyx mori Bmdsx gene. Genetics and Molecular Research 13 (3): 5452-5462 (2014)

    【8】Chao Zhang, Rongchao Ge, Junwen Zhang, Identification and Expression Analysis of a Novel HbCIPK2-Interacting Ferredoxin from Halophyte H. brevisubulatum.PLOS. December 4, 2015.

    【9】Deng X1, Guo D2, Yang S1, Shi M1, Chao J1, Li H2, Peng S2, Tian W1. Jasmonate signalling in the regulation of rubber biosynthesis in laticifer cells of rubber tree, Hevea brasiliensis. J Exp Bot. 2018 Jun 27;69(15):3559-3571. doi: 10.1093/jxb/ery169.


    酵母单杂交文库客户文章示例:

    【1】Nobutaka Mitsuda,Miho Ikeda,Shinobu Takada,et al.Efficient Yeast One-/Two-Hybrid Screening Using a Library Composed Only of Transcription Factors in Arabidopsis thaliana.Plant Cell Physiol (2010) 51 (12): 2145-2151.

    【2】Chang-Qing Yang1, Xin Fang1, Xiu-Ming Wu1, et al. Transcriptional Regulation of Plant Secondary Metabolism. Journal of Integrative Plant Biology 2012, 54 (10): 703–712

    【3】Zejun Huang, Zhijin Zhang, Xiuling Zhang,et al. Tomato TERF1 modulates ethylene response and enhances osmotic stress tolerance by activating expression of downstream genes. FEBS Letters.Volume 573, Issues 1–3, 27 August 2004, Pages 110-116

    【4】Deng X1, Guo D2, Yang S1, Shi M1, Chao J1, Li H2, Peng S2, Tian W1. Jasmonate signalling in the regulation of rubber biosynthesis in laticifer cells of rubber tree, Hevea brasiliensis. J Exp Bot. 2018 Jun 27;69(15):3559-3571. doi: 10.1093/jxb/ery169.

    膜蛋白双杂交文库客户文章示例:

    【1】Yasuyuki Nakamura, Jun Ishii, Akihiko Kondo. Rapid, Facile Detection of Heterodimer Partners for Target Human G-Protein-Coupled Receptors Using a Modified Split-Ubiquitin Membrane Yeast Two-Hybrid System.PLOS one. June 2013 , Volume 8 ,Issue 6.

    【2】Zhe Ma, Hui Zhang, Junxi Zheng. Interaction between M-Like Protein and Macrophage Thioredoxin Facilitates Antiphagocytosis for Streptococcus equi ssp. Zooepidemicus.PLOS one. February 2012 ,Volume 7, Issue 2.

    【3】Pratima Pandey and Singh Harbinder. The Caenorhabditis elegans D2-like dopamine receptor DOP-2 physically interacts with GPA-14, a Gαi subunit. Pandey and Harbinder Journal of Molecular Signaling 2012.

     中文论文:

    【1】张云云,周 君, 李 晔. 可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)酵母双杂交文库和铁结合蛋白真核表达载体的构建. 海洋与湖沼,44卷,第6期。

    【2】欧阳沫, 唐潇,黄惜,袁红梅。巴西橡胶树HbICE1 基因酵母双杂交诱饵载体的构建及互作蛋白的筛选。植物科学学报,2016,34(2): 255~262.

    【3】岳珊珊,夏来新。酵母双杂交筛选与果蝇C(2)M相互作用的蛋白。遗传,2015.11,37(11)

    【4】专利:一种结合串联重复序列(TTTACAC)5的Dof蛋白质



    文库构建

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